Estudio y preparación de biocatalizadores basados en lipasa inmovilizada en diferentes soportes. Aplicación a la obtención de biodiesel

García González, Sergio (2017). Estudio y preparación de biocatalizadores basados en lipasa inmovilizada en diferentes soportes. Aplicación a la obtención de biodiesel. Proyecto Fin de Carrera / Trabajo Fin de Grado, E.T.S.I. Industriales (UPM).

Descripción

Título: Estudio y preparación de biocatalizadores basados en lipasa inmovilizada en diferentes soportes. Aplicación a la obtención de biodiesel
Autor/es:
  • García González, Sergio
Director/es:
  • Fernández López, María Ascensión
Tipo de Documento: Proyecto Fin de Carrera/Grado
Grado: Grado en Ingeniería Química
Fecha: Septiembre 2017
Materias:
Palabras Clave Informales: Biocatalizadores, lipasa, inmovilización, actividad enzimática, estabilidad
Escuela: E.T.S.I. Industriales (UPM)
Departamento: Ingeniería Química Industrial y del Medio Ambiente
Licencias Creative Commons: Reconocimiento - Sin obra derivada - No comercial

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Resumen

El empleo de biocatalizadores es una práctica cada vez más extendida en la industria farmacéutica, alimentaria y química debido a la alta selectividad, alta especificidad y los beneficios medioambientales de las enzimas. A pesar de estas ventajas tienen el gran inconveniente de presentar arquitecturas complejas que las hacen lábiles e inestables sobre todo en las condiciones de reacción química donde se pretenden utilizar sus excelentes propiedades catalíticas. Se hace necesario, por tanto, estudiar formas de mejora de la estabilidad. La estrategia de estabilización más utilizada es la inmovilización, que consiste en limitar el movimiento de las enzimas en el medio de reacción. La inmovilización se realiza generalmente sobre soportes sólidos obteniendo así un catalizador insoluble que facilita su manipulación y permite la reutilización, siendo esta última otra importante ventaja. Sin embargo como consecuencia de esta mejora de estabilidad se produce, en mayor o menor extensión, pérdida de actividad enzimática debido a la heterogeneidad de uniones al soporte y efectos difusionales en su cinética, siendo esta la principal desventaja de los biocatalizadores inmovilizados. El objetivo principal de este trabajo es la preparación de derivados inmovilizados de lipasa de Candida rugosa en dos soportes diferentes. Para posteriormente realizar el estudio y caracterización de sus propiedades catalíticas en la reacción de hidrólisis de los ésteres implicados en la obtención de biodiesel. Las lipasas se han utilizado con éxito en una gran variedad de reacciones de interés industrial. En este trabajo la enzima seleccionada es la lipasa de Candida rugosa, se trata de un tipo de enzima hidrolítica cuya función natural es catalizar la hidrólisis de triacilglicéridos siendo esta la reacción que tiene lugar en el proceso de síntesis de biodiesel. Presentan una ventaja importante frente a otras enzimas hidrolíticas y es su capacidad de actuar en la interfase que se forma entre un medio orgánico y un medio acuoso. En el mecanismo de las reacciones de hidrólisis catalizadas por lipasas interviene una triada catalítica típica de estas enzimas formada por serina, ácido aspártico o glutámico e histidina, aminoácidos que conforman su centro activo e intervienen en la ruptura del enlace sencillo carbono-oxígeno tanto de ácidos carboxílicos como ésteres. Además, el centro activo se encuentra protegido por una “tapadera” que en la interfase se retira cambiando la configuración de lipasa cerrada a abierta dejando al centro activo accesible y permitiendo su unión con la interfase. La configuración cerrada por otra parte, protege al centro activo de la acción de los posibles inhibidores. En cuanto a los soportes de inmovilización se han utilizado dos materiales que permiten preparar tres biocatalizadores diferentes desde el punto de vista de su unión, física o química, a la proteína. - Nylon-6 activado previamente por reacción con glutaraldehído que mediante sus grupos aldehídos establece uniones covalentes con el soporte y proporciona el brazo espaciador que dará lugar a la unión covalente con los grupos amino libres de la superficie de la enzima. - Nylon-6 parcialmente hidrolizado los grupos carboxílicos libres permiten la unión covalente directa con los grupos amino de la proteína - Amberlite XAD7, resina sintética que proporciona una inmovilización física. La macroestructura porosa y el carácter hidrofóbico de esta resina permiten que la proteína se adsorba en su superficie a través de fuerzas de unión tipo dipolo. Para poner de manifiesto las propiedades catalíticas de estos derivados y su posible aplicación en reacciones de interés industrial, se decide ejemplificar su estudio a través de la reacción de hidrólisis de un éster, que permite determinar los parámetros cinéticos de los derivados enzimáticos preparados y estudiar las variables que afectan a la reacción. El estudio y comparación de los resultados encontrados para cada uno de los derivados inmovilizados lleva a la propuesta del biocatalizador más adecuado que junto con las condiciones de reacción determinadas permitan diseñar una propuesta del proceso de síntesis. La síntesis de biodiesel transcurre en tres etapas en las cuales la lipasa ejerce su actividad hidrolítica, en la primera se forman diglicéridos en la siguiente monoglicéridos y en la última glicerol y los esteres metílicos que conforman el biodiesel. La biocatálisis resulta especialmente atractiva debido a sus propiedades respetuosas con el medioambiente además de suponer una alternativa al agotamiento de los actuales combustibles fósiles. La metodología para llevar a cabo este trabajo se basa en la hidrólisis catalítica de un sustrato modelo como es el 4-Nitrofenil palmitato. Los puntos clave de esta metodología son la puesta a punto de los protocolos de inmovilización de la lipasa en ambos soportes así como el estudio de las condiciones que permitan una comparación entre ellos y la lipasa libre. A través de esta metodología, se ha realizado un trabajo experimental en el laboratorio que conduce a la preparación de tres nuevos derivados inmovilizados de los que se han determinado sus propiedades catalíticas. En primer lugar, se llevan a cabo estudios de actividad y estabilidad frente a variables como la temperatura, el pH, el tiempo de reacción para ser comparados con el estudio de la enzima libre. Posteriormente se determina la carga enzimática sobre los soportes como parámetro importante de la inmovilización y su efecto sobre la actividad. Una vez efectuada toda la parte experimental se obtienen algunos datos de interés que corroboran las hipótesis y resultados descritos en otros estudios y ponen de manifiesto algunas propiedades de los biocatalizadores inmovilizados que se desconocían. Las condiciones más adecuadas para la reacción catalítica de lipasas son temperaturas de 35-40ºC y pH neutro, condiciones a las que acostumbran a actuar en sus organismos de procedencia. Se observa en la Figura A. El soporte de Amberlite XAD7 sufre una desorción cuando el tiempo de inmovilización es lo suficientemente alto para que se sature de lipasa y el equilibrio de adsorción sufra una inversión. La unión covalente entre el Nylon-6 y la lipasa es directamente proporcional al tiempo de inmovilización en los periodos de incubación estudiados. La actividad catalítica de la lipasa inmovilizada en el Nylon-6 es mejor que la del Amberlite XAD7 para las condiciones óptimas de reacción, es decir, cuando la concentración de sustrato está saturada. Con estos resultados, se corroboran tanto las ventajas de estabilidad y reutilización de los derivados inmovilizados así como la desventaja de la pérdida de actividad frente a la lipasa libre. Tras el transcurso de 150 minutos, el porcentaje de actividad residual de los soportes se mantiene entorno al 65% mientras que el de la lipasa libre ha descendido hasta el 25%, poniendo de manifiesto la estabilización de la proteína mediante la inmovilización. La reutilización es otra ventaja característica de los derivados inmovilizados sólidos, perdiendo actividad a medida que aumentan los ciclos de uso del catalizador. Como se expone en la Figura C, la actividad de la lipasa inmovilizada sobre Nylon-6 en el 4º ciclo es el 50% de la inicial, observándose una tendencia a mantenerse en este rango de valores. En el resto de ensayos en los que se calcula la actividad enzimática destaca la diferencia de valores entre la lipasa libre y los derivados inmovilizados, llegando a ser la primera 3 veces mayor en condiciones óptimas de reacción, 3,02 U/mg lipasa libre frente a las 0,99 U/mg lipasa inmovilizada. Por último, las características macroscópicas de los derivados inmovilizados, teniendo en cuenta las condiciones de reacción determinadas y su comportamiento catalítico, permiten una propuesta de biocatalizador y una aproximación de biorreactor para el proceso de obtención de biodiesel. El biocatalizador que en este estudio resulta más factible desde el punto de vista de su manipulación sería el basado en lipasa inmovilizada en Nylon-6 sin hidrolizar y activado previamente con glutaraldehído. Cabe destacar que no se debe rechazar el derivado inmovilizado sobre Nylon-6 parcialmente hidrolizado, debido a que sus resultados de actividad son prometedores, pero sus características macroscópicas dificultan la aplicación del protocolo de determinación de sus propiedades catalíticas. Siendo este posiblemente, el principal punto de estudio en trabajos futuros. La carga enzimática del soporte de es de 0,77 mg de lipasa/mg de Nylon-6. Las condiciones más adecuadas de la reacción en todos los casos son de 40ºC y pH=7. Su estabilidad se conserva en el tiempo en un 65% y la reutilización lleva hasta 4 ciclos de proceso con una actividad significativa. Lo expresado anteriormente es compatible con un lecho fijo en un biorreactor de flujo pistón. La ausencia de agitación respeta la morfología del biocatalizador y la continuidad de flujo conduce a una mayor producción y eliminación de medios inhibidores que pudieran desactivar la proteína.

Más información

ID de Registro: 47807
Identificador DC: http://oa.upm.es/47807/
Identificador OAI: oai:oa.upm.es:47807
Depositado por: Biblioteca ETSI Industriales
Depositado el: 19 Sep 2017 06:30
Ultima Modificación: 19 Sep 2017 06:30
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