Fusarium circinatum – host interaction : ecological and molecular aspects of the pathogenic and endophytic association

Hernández Escribano, Laura (2019). Fusarium circinatum – host interaction : ecological and molecular aspects of the pathogenic and endophytic association. Thesis (Doctoral), E.T.S. de Ingeniería Agronómica, Alimentaria y de Biosistemas (UPM). https://doi.org/10.20868/UPM.thesis.57391.

Description

Title: Fusarium circinatum – host interaction : ecological and molecular aspects of the pathogenic and endophytic association
Author/s:
  • Hernández Escribano, Laura
Contributor/s:
  • Raposo Llobet, Rosa
Item Type: Thesis (Doctoral)
Date: 2019
Subjects:
Faculty: E.T.S. de Ingeniería Agronómica, Alimentaria y de Biosistemas (UPM)
Department: Biotecnología - Biología Vegetal
Creative Commons Licenses: Recognition - No derivative works - Non commercial

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Abstract

Fusarium circinatum Nirenberg & O’Donnell es el agente causante de la enfermedad del chancro resinoso del pino, reconocida como una de las enfermedades de coníferas más graves, afectando a más de 57 especies de pino y causando importantes pérdida económicas y medioambientales en viveros y plantaciones forestales. Tradicionalmente, F. circinatum ha sido considerado exclusivamente un patógeno de pinos, sin tener en cuenta la posibilidad de otras relaciones simbióticas con su huésped. Sin embargo, recientemente ha sido detectado colonizando como endófito especies pertenecientes a la familia de las gramíneas, sin causar daños aparentes. El objetivo principal de esta tesis es el estudio de los aspectos ecológicos y moleculares en la interacción de F. circinatum con sus huéspedes, explorando las distintas formas de vida del hongo, bien como endófito o como patógeno. En el capítulo 4 de esta tesis exploramos el rango de huéspedes no sintomáticos de Fusarium circinatum en una parcela de Pinus radiata con síntomas de la enfermedad. También determinamos si estos huéspedes no sintomáticos pueden actuar como fuente de inóculo. F. circinatum fue detectado en 5 especies de familias pertenecientes al grupo de las dicotiledóneas (Asteraceae, Lamiaceae, Rosaceae), además de en dos especies de gramíneas (Poaceae). Sólo fue detectado en la parte aérea de estas plantas, por lo que describimos F. circinatum como un endófito de transmisión principalmente aérea. El hongo fue también detectado en semillas de la especie Hypochaeris radicata, por lo que la transmisión vertical podría ser posible, al menos en esta especie. Los hongos endófitos frecuentemente esporulan en el tejido senescente de plantas infectadas. En condiciones de laboratorio, hemos demostrado que las plántulas de pino pueden infectarse a partir de tejido senescente de plantas no sintomáticas pero colonizadas por el hongo. También hemos explorado el endofitismo de F. circinatum en pinos adultos. Estudios previos han descrito que el hongo puede permanecer en estado de latencia en plántulas de pino. Además, el estudio de esta fase latente en el ciclo de la enfermedad ha estado centrado en la parte aérea del huésped, pero no en raíces. En el presente trabajo se detecta F. circinatum en raíces de árboles adultos no sintomáticos en plantaciones de Pinus pinaster y P. radiata, en las que el patógeno está presente y causa chancros en los árboles, síntoma característico de la enfermedad. El hongo fue aislado con una mayor frecuencia en raíces de árboles no sintomáticos de P. radiata que en árboles sintomáticos. Además, la presencia de F. circinatum en las raíces parece que estar influenciada por el grado de susceptibilidad de las especies, ya que no fue detectada en raíces de P. pinaster, especies con una moderada resistencia al patógeno. Un análisis basado en marcadores moleculares de tipo microsatélite reflejó la presencia de un único haplotipo en toda la población de F. circinatum, independientemente de que el origen del aislado fuera chancros de pino, raíces de pinos asintomáticos o plantas herbáceas no sintomáticas. Por lo tanto, el mismo haplotipo del hongo puede adoptar una forma de vida endofítica o patogénica. Además, todos los aislados resultaron ser patogénicos en plántulas de pino inoculadas artificialmente. Estos resultados evidencian el riesgo potencial de dispersión de F. circinatum a través de especies no sintomáticas que sirven como reservorio de inóculo y abren nuevos interrogantes para el estudio de la epidemiología de la enfermedad. Por otro lado, la colonización de raíces supone un factor importante en el ciclo de la enfermedad que debe ser tenido en cuenta para un correcto manejo de la enfermedad y, en particular, para las medidas de erradicación y control. A pesar de la gravedad de la enfermedad del chancro resinoso del pino, el conocimiento de la base molecular de la interacción de F. circinatum con las distintas especies de pino es limitado. P. pinaster es una especie de gran importancia económica y medioambiental en la región mediterránea y, aunque han sido descritas infecciones naturales en plantaciones, la especie presenta una moderada resistencia al patógeno. Por este motivo, estudiamos la interacción F. circinatum-P. pinaster a nivel molecular (capítulo 6), tratando de identificar los procesos y rutas metabólicas que están involucrados en la resistencia y virulencia de planta y patógeno, respectivamente. Para ello, ante la ausencia de un genoma de referencia, creamos un transcriptoma de novo de buena calidad para P. pinaster (capítulo 5), que usaremos posteriormente como referencia para el análisis de expresión diferencial de genes. Mediante la técnica de secuenciación dual del ARN (dual RNA-seq) determinamos el perfil transcriptómico de ambos organismos, huésped y patógeno, durante el proceso de infección a los 3, 5 y 10 días post-inoculación (capítulo 6). La moderada resistencia que P. pinaster muestra puede ser explicada en parte por la rápida activación de la respuesta de defensa, basada en la inducción de proteínas PR (Pathogeneis Related proteins) y la activación de una compleja señalización basada en fitohormonas que incluye al ácido salicílico, ácido jasmónico y etileno. Además, indicamos los puntos claves en los que F. circinatum puede estar manipulando el balance hormonal de la planta a su favor, contribuyendo así a una mayor susceptibilidad del huésped. Tras examinar los tránscritos del patógeno, proponemos que F. circinatum previene la biosíntesis del ácido salicílico a partir de la vía del corismato mediante la síntesis de la isocorismatasa hidrolasa (ICSH), perturba la homeostasis del etileno en el huésped mediante la expresión de genes relacionados con la biosíntesis del etileno y bloquea la señalización del ácido jasmónico mediante la supresión de COI1. En resumen, este trabajo estudia diversos aspectos de la interacción de F. circinatum con sus huéspedes y evidencia la importancia de una fase endofítica en el ciclo de vida del patógeno, que consecuentemente tiene implicaciones en el manejo de la enfermedad hasta ahora no consideradas. Además, exploramos los mecanismos moleculares involucrados en la interacción patogénica de F. circinatum con P. pinaster, analizando qué procesos moleculares y rutas metabólicas son responsables de la defensa de la planta y de la virulencia del patógeno, aportando nuevos conocimientos sobre los mecanismos por los cuales se produce la enfermedad. ----------ABSTRACT---------- Fusarium circinatum Nirenberg & O’Donnell, the causal agent of pitch canker disease, is one of the most important pathogens of conifers worldwide, affecting at least 57 species of Pinus, and causing important economic and environmental losses in nurseries and forest plantations. The fungus has been traditionally considered exclusively a pathogen of conifers, not taking into account the possibility of other symbiotic relationships with the host. The fungus was recently detected living as an endophyte in grasses causing no apparent damage. The main objective of this dissertation is to study ecological and molecular aspects of F. circinatum and its host association, exploring both endophytic and pathogenic lifestyles. In Chapter 4 we explored the non-symptomatic host range of the fungus in a plantation of Pinus radiata with symptoms of pine pitch canker (PPC) disease and we also tested whether this non-symptomatic host may act as a reservoir of inoculum. We detected the fungus in five species of dicot families (Asteraceae, Lamiaceae, Rosaceae), in addition to two species in the Poaceae. The fungus was found in the aerial part of non-symptomatic hosts, so we describe F. circinatum as an endophyte that is mainly transmitted by spores through the air. Vertical transmission may also occur at least in one species, Hypochaeris radicata, since fungus was detected in seeds of these plants. Endophytes frequently sporulate when infected host tissue dies, and we proved that pine seedlings can be infected from senescent tissue of non-symptomatic hosts colonized by the fungus under laboratory conditions. This endophytic stage of F. circinatum is not exclusive of herbaceous plants, since the existence of a latent stage within pine host tissue has previously been cited. However, studies on this cryptic phase in the disease life cycle have only been focused on the host aerial part but not on the roots. We analysed the presence of the F. circinatum in roots of non-symptomatic mature trees in Pinus pinaster and P. radiata plantations, where the pathogen is known to be causing canker symptoms. The fungus was isolated from roots of non-symptomatic P. radiata trees in a higher frequency than from roots of symptomatic trees. Host susceptibility seems to be involved in the presence of the pathogen in roots because it was not isolated from any roots in the P. pinaster plantation, pine species reported to have moderate resistance to the pathogen. An analysis of microsatellite markers showed a unique haplotype in F. circinatum population regardless of whether the isolates origin was pine cankers, symptomless pine roots or non-symptomatic herbaceous plants. Thus, the same haplotype can adopt a pathogenic or endophytic lifestyle. Indeed, all isolates resulted pathogenic to pines by artificial inoculations. These results show the potential risk of spread of F. circinatum across non-symptomatic species that serve as reservoirs of inoculum and provide insights into the epidemiology of pitch canker disease. In addition, root infection is a relevant factor in the disease cycle, and this finding needs to be considered hereafter in management of the PPC disease. In spite of the importance of the disease, knowledge of the molecular basis of the pathogenic interaction of F. circinatum with Pinus trees is limited. P. pinaster is an ecological and economical important species in the Mediterranean area and, although natural infections have been reported, the species have shown a moderate resistance to the pathogen. For these reason we study F. circinatum-P.pinaster interaction at a molecular level, trying to determine which mechanism are strongly involved in plant resistance and pathogen virulence. For this purpose, in the absence of a reference genome, we generated a high quality de novo P. pinaster transcriptome assembly (Chapter 5), used for downstream gene expression analyses. By a dual RNA-sequencing approach, we determined the expression profiling of both organisms during the interaction at 3, 5 and 10 days post-inoculation (Chapter 6). The moderate resistance that P. pinaster showed at the early time points, may be explained, at least in part, by the early activation of defence response based on the induction of pathogenesis-related proteins and the activation of complex phytohormone signalling that involves crosstalk between salicylic acid, jasmonic acid and ethylene. Moreover, we hypothesize the key steps where the pathogen could be manipulating host phytohormone balance to its own benefit, contributing to host susceptibility. Upon examination of the pathogen transcripts, we propose that F. circinatum prevents salicylic acid biosynthesis from the chorismate pathway by the synthesis of isochorismatase family hydrolase (ICSH) genes, perturbs ethylene homeostasis in the host by expression of genes related to ethylene biosynthesis, and could be blocking jasmonic acid signalling by COI1 suppression. In summary, this work present a broader repertoire of interaction of F. circinatum with its hosts and evidence the importance that an endophytic stage of the pathogen may have in the disease lifecycle, and therefore, for disease management. Indeed, we explore the molecular mechanism involved in the pathogenic interaction of F. circinatum with P. pinaster, analysing which processes are responsible for plant defence and pathogen virulence, providing new knowledge in mechanisms by which PPC is caused.

Funding Projects

TypeCodeAcronymLeaderTitle
Government of SpainRTA2012-00015-C02-01UnspecifiedUnspecifiedManejo integrado de la enfermedad del chancro resinoso del pino causado por Fusarium circinatum en viveros y masas forestales
Government of SpainRTA2013-00048-C03-01UnspecifiedUnspecifiedProducción integrada en pinares de España: desde la diversidad de especies hasta los programas de mejora genética
Government of SpainRTA-2017-00063-C04-01UnspecifiedUnspecifiedEvaluación de caracteres relevantes para la gestión sostenible de P. pinaster Ait. y su interacción con nuevos escenarios climáticos

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Item ID: 57391
DC Identifier: http://oa.upm.es/57391/
OAI Identifier: oai:oa.upm.es:57391
DOI: 10.20868/UPM.thesis.57391
Deposited by: Archivo Digital UPM 2
Deposited on: 27 Jan 2020 07:05
Last Modified: 27 May 2020 22:30
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