%A Alba Jim?nez Gonz?lez
%T Implementaci?n de m?todo para detecci?n de microorganismos en vino blanco
%X Las t?cnicas moleculares proporcionan una herramienta excepcional para la detecci?n, identificaci?n y caracterizaci?n de microorganismos que est?n implicados en ecosistemas ambientales y de alimentos. Sin embargo, el estudio de la biodiversidad microbiana todav?a est? obstaculizado por la dificultad de identificar y de caracterizar los microorganismos sin aislamiento previo en medios de cultivo ya que durante el cultivo o el uso de medios de enriquecimiento, se puede alterar la estructura de la comunidad imponiendo nuevas condiciones selectivas. Es por ello que no se puede tener un conocimiento completo de la diversidad microbiana de un ecosistema dado, ya que s?lo se puede caracterizar una parte, las cepas cultivables. Entre los diferentes organismos que se pueden identificar por estas t?cnicas moleculares se encuentran las levaduras. 
Las levaduras cumplen un papel fundamental en la elaboraci?n del vino ya que son responsables de la conversi?n de az?cares fermentables en etanol y anh?drido carb?nico. A partir de este proceso se producen una serie de metabolitos en menor cantidad que aportan caracter?sticas sensoriales fundamentales al vino. Tradicionalmente la fermentaci?n alcoh?lica del mosto se produc?a de forma espont?nea, a partir de levaduras ?salvajes?, o aut?ctonas, presentes en las uvas. De este proceso fermentativo espont?neo se obtienen vinos poco reproducibles, con elevados riesgos de alteraciones microbiol?gicas y qu?micas (ej. picados ac?ticos, defectos arom?ticos, ralentizaciones o paralizaciones en el proceso de fermentaci?n, etc.), y, en general, con tiempos de fermentaci?n m?s largos. En su mayor?a, las levaduras seleccionadas actuales corresponden a aislados del g?nero Saccharomyces, habitualmente de la especie Saccharomyces cerevisiae ya que se considera un microorganismo domesticado por encontrarse de forma abundante en los ambientes industriales en los que se realizan fermentaciones alcoh?licas, mientras que es relativamente escasa en ambientes naturales o no alterados por actividades humanas. Sin embargo, durante el proceso de vinificaci?n en sus m?ltiples etapas puede producirse un crecimiento microbiano no deseado que altere la calidad organol?ptica del vino. Dentro de estos microorganismos se encuentran levaduras no-Saccharomyces que pertenecen a diferentes g?neros (Cocolin et al., 2003 y Carrascosa et al., 2005). 
En los ?ltimos a?os, se han realizado muchos estudios describiendo la aplicaci?n de herramientas de biolog?a molecular para diferenciar y caracterizar levaduras utilizadas en la fermentaci?n industrial (Esteve-Zarzoso et al., 1999), siendo una de las t?cnicas m?s utilizadas para ello la reacci?n en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction, PCR). Este m?todo es capaz de amplificar un segmento de ADN en un bill?n de copias id?nticas y de conseguir la detecci?n espec?fica de secuencias de ADN posibilitando la identificaci?n de microorganismos contaminantes (Ibeas et al., 1996 y Suarez et al., 2007). Esta t?cnica consta de tres pasos b?sicos: Desnaturalizaci?n, apareamiento, y extensi?n que constituyen un ciclo, y son repetidos de 30 a 40 veces dando como resultado la copia de una porci?n de la mol?cula de ADN de doble cadena para producir dos cadenas ADN hijas, despu?s de dos ciclos habr? 4 copias, etc., siendo este un aumento exponencial en el n?mero de copias. Una vez obtenido el amplificado de dicho ADN se puede analizar mediante electroforesis en gel de poliacrilamida o agarosa. 
Adem?s de esta t?cnica se utiliza otro m?todo molecular para la identificaci?n de microorganismos basado en la determinaci?n del polimorfismo de longitud de los fragmentos de restricci?n (restriction fragment length polymorphism, RFLP), mediante su empleo se pueden diferenciar los organismos por el an?lisis de los patrones de ruptura que se generan en un sitio espec?fico del genoma del microorganismo, cuando es cortado por enzimas de restricci?n o endonucleasas y luego son comparados en gel por medio de electroforesis. La aparici?n de estos fragmentos polim?rficos es debido a que los organismos de diferentes especies, e incluso cepas, difieren en la distancia de los sitios de clivaje para cada enzima de restricci?n. (Rat?n, 2004) 
La extracci?n de ADN de cualquier organismo, a un bajo coste y sin un gran esfuerzo de trabajo en el laboratorio obteniendo una concentraci?n y pureza suficiente en poco tiempo son factores importantes. Esto se hace relevante para aquellos investigadores dedicados a la clasificaci?n, identificaci?n y filogenia de las levaduras, donde est? demostrado que las t?cnicas que existen tanto bioqu?micas, fisiol?gicas, metab?licas y gen?ticas no alcanzan a ser suficientes para identificar definitivamente el g?nero o la especie (Esteve-Zarzoso et al., 1999). Se han descrito numeroso m?todos de extracci?n de ADN de levaduras diferenci?ndose b?sicamente en el tipo de procedimiento utilizado para la lisis de la pared celular de la levadura, y el protocolo utilizado para la purificaci?n del ADN. Casi todos los m?todos que se emplean son variaciones tanto de procedimientos de agitaci?n con perlas de vidrio (Hoffman y Winston, 1987; Ros-Chumillas et al.,2007) como de lisis de pared celular por tratamiento enzim?tico (Querol et al., 1992). La eficacia en estos m?todos de extracci?n de ADN se ve afectada por diversos factores como son una lisis incompleta de la c?lula, la presencia de inhibidores enzim?ticos, la posible degradaci?n del ADN o la absorci?n del ADN a materiales externos. Es por ello, que el m?todo de extracci?n de ADN que se utilice es de vital importancia para lograr los resultados con la mejor calidad en an?lisis posteriores. 
En el caso de la industria vin?cola, ?sta cada vez se hace m?s globalizada y competitiva y la extracci?n de levaduras juega un papel fundamental teniendo los productores de vino que afrontar el desaf?o de mejorar las caracter?sticas organol?pticas de sus vinos y desarrollar la tipicidad para vinos arom?ticos complejos. Actualmente, la elaboraci?n de vinos es una actividad de gran inter?s econ?mico en Chile abarcando principalmente la parte central del pa?s. Generalmente, las vinificaciones se realizan mediante la inoculaci?n de levaduras comerciales provenientes de diferentes or?genes, de esta forma se pretende asegurar la correcta realizaci?n de la fermentaci?n as? como la obtenci?n de vinos de calidad m?s uniforme a lo largo de las diferentes campa?as (Rib?reau-Gayon, 1985; Giudici y Zambonelli, 1992; Fleet y Heard, 1993) con el inconveniente de la p?rdida de tipicidad y originalidad del producto. En el caso de Chile, su aislamiento y disposici?n geogr?fica hace posible que puedan existir cepas aut?ctonas chilenas con propiedades tecnol?gicas que pueden ser id?neas para su utilizaci?n como in?culos en futuros productos, agrupando as?, las caracter?sticas beneficiosas de la inoculaci?n pero manteniendo la tipicidad de la zona. Uno de los grandes desaf?os para la industria vitivin?cola chilena es el desarrollo de una metodolog?a espec?fica para sus vinos pues Implementaci?n de m?todo para detecci?n de microorganismos en vino blanco que al tratarse de una matriz compleja los m?todos de extracci?n deben de ser lo m?s seguros, fiables y eficientes para obtener muestras puras de ADN. 
El objetivo de este proyecto es implementar una nueva t?cnica en la extracci?n de ADN detectando la levadura Saccharomyces cerevisiae comercial EC1118 facilitando el procesamiento de la matriz, que en este caso es de vino blanco. Para ello en primer lugar se har? crecer la levadura EC1118 en medio de cultivo YEPD y se aplicar? el m?todo convencional de extracci?n mediante PowerSoil DNA isolation kit, se har? PCR y RFLP para verificar que se ha extra?do ese ADN y se guardar? como positivo para experiencias posteriores. En la segunda parte, se volver? a preparar esta levadura para ensayo y tras su recuento en c?mara de Neubauer se escoger? un volumen que permita obtener esas levaduras en 200 mL de vino blanco para una serie de concentraciones dadas. Se proceder? a extraer el ADN con el m?todo tradicional y con el nuevo, PowerWater DNA isolation kit y se realizar? la PCR para cada diluci?n con los dos m?todos. 
Los resultados de este proyecto muestran que al aplicar el PowerWater DNA isolation kit se obtienen amplificados para un n?mero mayor de concentraciones y las bandas amplificadas son m?s n?tidas, siendo por tanto m?s eficaz y presentando mayor calidad el ADN extra?do. Sin embargo, el m?todo de aplicaci?n es m?s complicado y delicado necesitando m?s tiempo para llegar al resultado final siendo adem?s su coste m?s elevado. Estos resultados abren las puertas a la instauraci?n de este m?todo de extracci?n de ADN y poder avanzar as? en la diferenciaci?n y caracterizaci?n de diferentes organismos, en este caso en particular las levaduras para su uso en la industria vitin?cola.
%D 2016
%I Industriales
%L upm43955