Optimizing DNA isolation from recalcitrant tree root material for successful molecular genetic analysis

Abstract

El proyecto tiene como objetivo determinar cuáles son las condiciones más adecuadas para el proceso de extracción de ADN de material leñoso procedente de raíces, de manera que se realice con éxito la PCR, secuenciación y finalmente identificación de las especies utilizadas. El estudio se centra en la optimización del procedimiento llevado a cabo en el laboratorio de Botánica Forestal de la Universidad de Friburgo, al que se encuentra asociado un servicio de identificación de especies a través de material radical. Por lo tanto, se busca determinar qué tejidos de raíz y métodos de extracción proporcionan los mejores resultados en términos de rendimiento y pureza del ADN y de éxito en la PCR y en la identificación final. Para el estudio 4 pares de primers fueron utilizados en la PCR (ITS1-ITS4, ITS5-ITS4, trnL, psbA-trnH), y su eficacia fue comparada. Una vez obtenidas las muestras de raíces leñosas, el material es preparado distinguiendo dos tejidos: floema (corteza) y xilema (madera). A continuación, se realizan extracciones con diferentes métodos basados tanto en kits comerciales como en protocolos tradicionales CTAB; distintas modificaciones son realizadas en los protocolos buscando maximizar su efectividad. Tras las extracciones se recogen los datos de rendimiento de ADN y de pureza obtenida. Seguidamente se realiza la PCR con los extractos obtenidos y se determina su tasa de éxito mediante una electroforesis en gel que permite identificar el tamaño de los fragmentos logrados. Por último, las muestras de ADN que han mostrado una suficiente intensidad de bandas en el gel, son limpiadas y secuenciadas. Los resultados de la secuenciación son cotejados con los contenidos en la base de datos online GenBank utilizando el algoritmo de alineamiento BLAST para lograr la identificación de las muestras. El estudio analiza paralelamente otras cuestiones secundarias como el efecto de sucesivos ciclos de congelado y descongelado en la concentración de ADN y la relación entre la cantidad de material inicial utilizado y el rendimiento de ADN de la muestra. ----------ABSTRACT---------- The aim of the present study is to define the most suitable conditions during the process of DNA extraction from plant woody root material, to obtain a successful PCR, sequencing and finally identification of the species used. The study focuses on the optimization of the procedure carried out in the laboratory of Forest Botany of the University of Freiburg, which offers a service of tree identification through root samples. The goal is to determine which tissues and extraction methods provide the best results in terms of DNA yield and purity, PCR and identification success. 4 pairs of primers were used for the PCR (ITS1- ITS4, ITS5-ITS4, trnL, psbA-trnH) and their efficiency was compared. After collection of the root samples, the material is prepares distinguishing two tissues: phloem (bark) and xylem (wood). Then, DNA extractions with different commercial kits and traditional CTAB methods are performed; different modifications are conducted searching for an improvement in the effectiveness. After the extractions results of DNA yield and purity are recorded. Subsequently, PCR is carried out with the extracts obtained and the rate of success is determined by means of a gel electrophoresis that shows the size of the DNA fragments. Finally, the DNA samples which showed enough band intensity are cleaned up and sequenced. Sequencing results are compared with the data from the GenBank online dataset, using the algorithm BLAST to achieve the correct identification. At the same time, secondary questions such as the effect of repeated cycles of freezethawing on DNA concentration and the relation between amount of initial sample and DNA yield are analysed.