Genes de plantas para resistencia transgénica frente a insectos. (Conferencia pronunciada el día 27 de febrero de 1996)

Abstract

Las técnicas del ADN recombinante están contribuyendo no sólo a la elucidación de los mecanismos fisiológicos básicos de las plantas a nivel molecular sino también a aumentar la variabilidad disponible para la mejora genética ya que ahora tenemos una metodología para aislar un gen de cualquier origen (vegetal, animal, bacteriano o incluso sintético), podemos producirlo en gran cantidad en una bacteria, y podemos reinsertarlo en la planta que interese. La herramienta básica del mejorador de plantas, la hibridación sexual, puede ser ahora complementada con la transferencia de pequeños fragmentos de ADN conteniendo uno o varios genes, sin requerir de retrocruzamientos largos y costosos. Para lograrlo, se necesitan además de la caracterización molecular de los genes a introducir, vectores adecuados y métodos eficientes para transformar y seleccionar las células vegetales transformadas, así como para regenerar plantas completas a partir de ellas. El principal objetivo de la transgénesis vegetal sería, por tanto, insertar establemente un ADN concreto en el genoma nuclear de una célula vegetal capaz de dar lugar a una planta transformada completa. Transformación sin regeneración o regeneración sin transformación estable no servirían nuestros propósitos. Muchas células vegetales son totipotentes y pueden ser estimuladas a regenerar plantas completas "in vitro", vía organogénesis (formación debrotes) o embriogénesis, siempre que en el medio de cultivo se mantenga un balance nutricional y hormonal apropiado. Estas células totipotentes (competentes) habrán de ser identificadas para poder ser transformadas y los procedimientos de regeneración serán diseñados para minimizar el "stress genómico" que podría conllevar la aparición de anomalías cromosómicas y/o genéticas en las plantas regeneradas (variación somaclonal). Los vectores utilizados para la transformación de plantas, deben llevar genes "marcadores" que permitan seleccionar (genes seleccionables) y/o reconocer las células transformadas (genes delatores). Estos genes, dominantes y generalmente de origen microbiano, se ponen bajo el control de promotores eucarióticos fuertes que sean funcionales en las plantas. Los genes marcadores selectivos (Tabla I), codifican proteínas cuya actividad enzimática permite el crecimiento celular en presencia de antibióticos o herbicidas, bien porque destoxifican al agente selectivo (KanamicinaR, FosfinotricinaR) o porque codifican enzimas que manteniendo sus propiedades catalíticas no interaccionan con dicho agente (GlifosatoR). Para que la selección sea efectiva, las células vegetales sin transformar deben ser susceptibles a concentraciones relativamente bajas del correspondiente agente selectivo. Los genes marcadores delatores codifican proteínas cuya actividad enzimática se puede detectar fácilmente utilizando los sustratos adecuados. Los más utilizados codifican los enzimas 6-glucuronidasa (Gus; Jefferson1987), luciferasa (Lux; Koncz et al. 1990), B-galactosidasa (Lac Z; Helmer et al. 1984) y más recientemente se ha introducido el gen que codifica la denominada proteína fluorescente verde (Niedz et al. 1995). Obviamente estos genes sólo serán útiles si no existe la misma actividad enzimática endógena en las células no transformadas. Los genes delatores son de gran utilidad en el estudio funcional de promotores, bien mediante transformación estable (Díaz et al. 1995) o mediante expresión transitoria, que permite evaluarlos a las 24- 48 horas después de la transferencia del ADN (Díaz 1994). Otros componentes de los vectores de transformación incluyen secuencias dianas para varias endonucleasas de restricción ("múltiple cloning sites") donde clonar el gen deseado, un origen de replicación bacteriano y un marcador procariótico seleccionable para mantenimiento y selección del plásmido en Escherichia coli. Plásmidos bacterianos de este tipo, conteniendo además un gen seleccionable en plantas, pueden usarse directamente como vectores de transformación en el método "biolístico" (pistola de genes). En vectores diseñados para utilizar en Agrobacterium otras manipulaciones son necesarias.