Purification and characterization of NifB from Chloroflexi

Abstract

NifB tiene un papel crucial en la biogénesis de la nitrogenasa, enzima responsable de la fijación del nitrógeno atmosférico (N2) a amonio (NH3), proceso conocido como Fijación Biológica del Nitrógeno. NifB es una proteína que pertenece a una familia de proteínas conocida como ?SAM-radical proteins? y cataliza la síntesis del cofactor metálico NifB-co, [Fe8-S9-C] a partir de dos ?clusters? sulfo-férricos del tipo [Fe4-S4] y dos moléculas de SAM. NifB-co sirve como intermediario en la biosíntesis de los sitios activos (cofactores metálicos) de todas las nitrogenasas conocidas, donde la más común es la nitrogenasa de molibdeno, cuyo cofactor, conocido como FeMo-co, consiste en [Fe7-S9-C-Mo-Homocitrato]. Inicialmente, NifB fue purificado a partir de microorganismos diazotrofos como Azotobacter vinelandii o Klebsiella oxytoca. Ambas especies son ?-proteobacterias mesofílicas de vida libre, distribuidas en suelos cuyo NifB presenta una arquitectura con dos dominios, el dominio SAM-radical y el dominio NifX. Sin embargo, en estudios recientes se ha purificado satisfactoriamente NifBs procedentes de metanógenos termofílicos que presentan únicamente el dominio SAM-radical en su estructura, expresados de forma heteróloga en E. coli. En el trabajo presentado en el congreso ENFC 2018, se ha purificado y caracterizado NifB de una bacteria perteneciente al filo Chloroflexi, Roseiflexus sp. RS.1. Este NifB termorresistente, es estructuralmente similar a NifBs procedentes de arqueas y únicamente presenta el dominio SAM. En este estudio se muestras las propiedades bioquímicas de NifB de Roseiflexus y su capacidad para sintetizar NifB-co en ensayos de síntesis e inserción de FeMo-co in vitro, para la activación de la enzima nitrogenasa. NifB de Roseiflexus es termorresistente, llega a alcanzar un total de 9 átomos de hierro por monómero y presenta propiedades espectroscópicas compatibles con la presencia de tres clusters [Fe4-S4] tal y como se ha reportado para su homólogo NifB de Methanocalcococcus infernus. ----------ABSTRACT---------- NifB has a crucial role in the biogenesis of active nitrogenase, the enzyme responsible of fixing atmospheric N2 to NH3 in a process known as biological nitrogen fixation (BNF). NifB is a SAM-radical protein that catalyzes the synthesis of a metal cluster, NifB-co [Fe8-S9-C], from two [Fe4-S4] cluster units and a molecule of SAM. NifB-co serves as intermediate in the biosynthesis of the active-site cofactors of all known nitrogenases(1,2). NifB has been purified from mesophilicγ–proteobacteria, having dual domain architectures based on a SAM-radical domain and a NifX-like domain(3). However, recent studies have successfully used NifB proteins from thermophillic methanogens that present a SAM-radical-domain-only architecture(4,5). In this work, NifB from Roseiflexus sp. RS-1 was heterologously expressed in Escherichia coli and purified to be used as adiitional model to further understand how NifB proteins synthesize NifB-co. Roseiflexus sp. RS-1 is a filamentous bacterium that belongs to the phylum Chloroflexi. It has thermophilic lifestyle, growing at 60ºC. This phylum is found near the most primitive branches of the phylogenetic tree, constituting an interesting candidate to study the most primitive forms of NifB and its co-evolution with the nitrogenase complex.