Effect of cellobiose and dietary soluble fibre on fermentation, growth performance and health in rabbits

Ocasio Vega, César Enrique (2018). Effect of cellobiose and dietary soluble fibre on fermentation, growth performance and health in rabbits. Thesis (Doctoral), E.T.S. de Ingeniería Agronómica, Alimentaria y de Biosistemas (UPM). https://doi.org/10.20868/UPM.thesis.50232.

Description

Title: Effect of cellobiose and dietary soluble fibre on fermentation, growth performance and health in rabbits
Author/s:
  • Ocasio Vega, César Enrique
Contributor/s:
  • García Alonso, Javier
Item Type: Thesis (Doctoral)
Date: 2018
Subjects:
Faculty: E.T.S. de Ingeniería Agronómica, Alimentaria y de Biosistemas (UPM)
Department: Producción Agraria
Creative Commons Licenses: Recognition - No derivative works - Non commercial

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Abstract

La presente tesis constituye un avance en el conocimiento de la suplementación de la celobiosa en el agua de bebida de los conejos y su posible relación con el nivel de fibra soluble en el pienso. Existe un efecto positivo de la fibra soluble en la salud digestiva del conejo y por lo tanto, en la reducción de la mortalidad en los conejos destetados. Sin embargo, esto no parece resolver el problema que enfrentan los productores. Esta tesis pretende: 1) determinar las dosis adecuadas de celobiosa para suplementar al conejo y su interacción potencial con el nivel de fibra soluble incluido en el pienso, 2) caracterizar el perfil fermentativo ileal y cecal de la celobiosa cuando se combina con diferentes niveles de fibra soluble, y 3) evaluar la influencia de la suplementación de celobiosa y fibra soluble en la fermentación cecal in vitro de celobiosa y otros alimentos ricos en carbohidratos. Estos objetivos fueron desarrollados en seis experimentos. En el experimento 1, el objetivo fue examinar si la combinación de fibra soluble y celobiosa ejerce un efecto sinérgico sobre los rendimientos productivos, el estado de salud, las características de la fermentación intestinal y la respuesta inmune en conejos. Se utilizaron seis tratamientos estructurados factorialmente (3 × 2): 3 concentraciones de celobiosa en agua de bebida (0,0, 7,5 y 15,0 g/L) × 2 niveles dietéticos de fibra soluble (84,0 y 130 g/kg MS, para la dieta baja fibra soluble (BFS) y para la dieta alta fibra soluble (AFS), respectivamente). Un total de 264 conejos (35/tratamiento) fueron destetados a los 34 d de edad y tuvieron acceso ad libitum a los alimentos y el agua. A los 46 d de edad, 9 conejos/tratamiento fueron sacrificados y se recogieron muestras de digesta ileal y cecal para analizar el perfil de AGV y la respuesta inmune en la mucosa del apéndice. A los 48 d de edad, se retiró la suplementación con celobiosa y los piensos experimentales se reemplazaron por una dieta comercial estándar hasta los 61 d de edad. De 34 a 48 d de edad hubo un aumento lineal de la mortalidad con el nivel de celobiosa en el grupo de AFS (0 frente a 17,1%, P = 0,003). Por el contrario, se encontró un efecto cuadrático del nivel de celobiosa sobre la mortalidad en el grupo BFS, donde los conejos a los que se les ofrecío 7,5-celobiosa mostraron la mortalidad más baja (5,7 vs. 21,4%, P = 0,030). El nivel de celobiosa tuvo un efecto cuadrático sobre el consumo medio diario (CMD), ganancia media diaria (GMD) y eficacia alimenticia (G:C) en este período (P ≤ 0,047), en los grupos de 7,5-celobiosa mostrando el mejor rendimiento de crecimiento. Por el contrario, a partir de los 48 días de edad solo se observaron cambios menores en estas variables. El nivel de celobiosa influyó cuadráticamente en las concentraciones ileales de AGV (P = 0,014), mostrando el valor máximo los grupos de 7,5-celobiosa. En conejos alimentados con 7,5-celobiosa-BFS, se encontró un cambio de acetato a propionato, butirato y valerato en el íleon (P ≤ 0,070). El aumento de los niveles de celobiosa redujo linealmente las concentraciones de AGV cecales en conejos alimentados con AFS, pero no se detectó ningún efecto en los grupos de BFS (P = 0,033). El nivel de fibra soluble aumentó las concentraciones de AGV tanto en el íleon (en un 22%, P < 0,001) como en ciego (en un 11%, P = 0,005). La expresión génica relativa de IL-6, IL-10 y TNF-α, iNOS, MUC-1 y receptores de tipo toll (TLR-2 y TLR-4) en el apéndice aumentaron de forma lineal y cuadrática con niveles crecientes de celobiosa (P ≤ 0,063). En conclusión, en conejos alimentados con dietas BFS se recomienda una dosis de 7,5 g de celobiosa/L, mientras que estos niveles de suplementación con celobiosa se deben evitar en conejos alimentados con dietas AFS. El segundo, tercer y cuarto experimento fue realizado para evaluar el efecto de suplementar celobiosa (≤ 7,0 g/L) sobre el rendimiento de conejos en crecimiento. En el experimento 2, se utilizaron seis tratamientos estructurados factorialmente (3 × 2): 3 concentraciones de celobiosa en agua (0.0, 3,5 y 7,0 g/L) × 2 piensos que difieron en el nivel de fibra soluble (71,9 vs. 130 g/kg DM, para las dietas baja en fibra soluble (BFS) y alta (AFS), respectivamente). Se utilizaron 192 gazapos destetados a los 26 d de edad, teniendo acceso ad libitum a los alimentos y el agua. Para el experimento 3, se evaluaron las mismas concentraciones de celobiosa del experimento 2 en conejos alimentados con una dieta BFS (71,9 g/kg MS), y 186 gazapos destetados a los 26 d de edad fueron utilizados. En el experimento 4, se emplearon cuatro tratamientos en una disposición factorial 2 × 2: 2 concentraciones de celobiosa en agua durante un período previo al destete × 2 concentraciones de celobiosa en agua durante el período posterior al destete (0,0 y 7,0 g/L en ambos períodos). Para la etapa pre-destete, los gazapos 20 camadas (10 gazapos/camada) fueron divididos en dos grupos (5 gazapos/grupo) hasta los 29 d de edad. A los 29 d de edad para la etapa post-destete 4 gazapos/camada fueron destetados y asignados al azar a dos tratamientos (0,0 y 7,0 g de celobiosa/L), obteniendo cuatro tratamientos. La suplementación de celobiosa afectó el consumo de alimento y eficacia alimenticia en todos los experimentos (P ≤ 0,045). En el experimento 2, suplementar 3,5 g de celobiosa / L aumentó (P = 0,017) su ganancia de peso en comparación con las otras concentraciones de celobiosa (0,0 y 7,0 g de celobiosa/L), resultando en un mayor peso a los 56 d de edad (P = 0,017). Los resultados de 26-40 d de edad del experimento 3, difieren de los del experimento 2, observando que el incremento de la concentración de celobiosa tendió a reducir la eficacia alimenticia (P = 0,098). A pesar de esto, de 40 a 50 d de edad (experimento 3) este incremento en la concentración de celobiosa aumentó la eficacia alimenticia (P = 0,009). En el experimento 4, de 22 a 29 d de edad (periodo previo al destete), la suplementación con celobiosa disminuyó (P = 0,042) la ingesta de alimento. Después del destete, de 29 a 43 d conejos suplementados con celobiosa, aumentaron (P ≤ 0,001) la ganancia de peso y la eficacia alimenticia (51,7 vs. 42,4 g / d 0,457 vs 0,385 g/g, respectivamente). El incremento de la concentración de celobiosa tendió a reducir la mortalidad en conejos alimentados con dietas BFS (experimentos 2 y 3, P ≤ 0,098). Por el contrario, en el experimento 4 suplementando los animales con celobiosa en ambos períodos tendieron a incrementar la mortalidad (P = 0,087). En conclusión, el suplemento de concentraciones de celobiosa (≤ 7,0 g/L) se recomienda para conejos alimentados con dietas BFS. En el quinto estudio, se investigó la influencia de la pre-digestión del sustrato y el pienso de los donantes en la fermentación cecal in vitro de diferentes sustratos en conejos. Ocho conejos fueron alimentados con dos piensos experimentales que contenían un nivel bajo (BFS; 84,0 g/kg MS) o alto de fibra soluble (AFS; 130 g/kg MS). Las incubaciones in vitro se llevaron a cabo utilizando heces blandas como inóculo y cuatro sustratos fibrosos o derivados de fibra, con bajo contenido de almidón y proteína: D-celobiosa (CEL), pectinas de remolacha (PEC), pulpa de remolacha (PR) y paja de trigo (Paja). En la mitad de de las incubaciones de cada sustrato se realizó una digestión in vitro de 2-pasos pepsina/pancreatina sin filtración, y se incubó el residuo completo (parte soluble, insoluble y enzimas añadidas) a 40ºC. La producción de gas se midió hasta las 144 h, y se determinó la producción de ácidos grasos volátiles (AGV) a las 24 h de incubación. Se incluyeron cultivos sin sustrato (blancos) para corregir los valores de producción de gas con el gas liberado de los sustratos endógenos y las enzimas añadidas. La pre-digestión no influyó en la cinética de producción de gas in vitro de la Paja, y solo redujo el tiempo de retraso con el que comenzó la producción de gas (Lag, en un 31%, P = 0,042) para la PR, pero para ambos sustratos la pre-digestión disminuyó la proporción molar de acetato (en un 9%; P ≤ 0,003) y aumentó las de propionato y butirato (P ≤ 0,014). Para la CEL, la pre-digestión aumentó el gas y la producción total de AGV (en 30 y 114%), acortó el tiempo tiempo de retraso con el que comenzó la producción de gas (en un 32%) y solo cuando se combinó con el inóculo BFS se reemplazaron 38 unidades porcentuales de acetato por butirato (P ≤ 0,039). Los tratamientos tuvieron una influencia menor en las características de la fermentación in vitro de la PR. Los resultados mostraron que el proceso de pre-digestión influyó en la fermentación cecal in vitro en conejos, pero los efectos fueron influenciados por el pienso de los donantes y el sustrato incubado. Sería recomendable una predigestión del sustrato antes de realizar fermentaciones cecales in vitro. El nivel de fibra soluble en el pienso de los donantes también influyó en la fermentación cecal in vitro, pero su efecto dependió del tipo de sustrato. En el último experimento, se investigó la fermentación cecal in vitro de cinco sustratos con bajo contenido de almidón y proteína [D - (+) - glucosa (GLU), D-celobiosa (CEL), pectinas de remolacha azucarera (PEC), pulpa de remolacha azucarera (PR) y paja de trigo (Paja)] utilizando como inóculo heces blandas de conejos que recibieron diferentes niveles de celobiosa y fibra soluble. Veinticuatro conejos fueron suplementados con tres niveles de celobiosa en el agua (0.0, 7,5 y 15,0 g/L) y alimentados con dos piensos experimentales que contenían un nivel bajo (BFS; 84,0 g/kg MS) o alto de fibra soluble (AFS; 130 g/kg MS). Todos los sustratos se sometieron a una pre-digestión in vitro de pepsina / pancreatina en dos etapas, y se utilizó el residuo completo como sustrato para las incubaciones in vitro. La producción de gas se midió hasta las 144 h, y la producción de ácidos grasos volátiles (AGV) se determinó a las 24 h de incubación. Los tratamientos experimentales no afectaron la fermentación de PR y solo tuvieron una ligera influencia en la fermentación de la Paja y la GLU. Por el contrario, la fermentación de la CEL se vio notablemente afectada, y se detectaron interacciones entre la suplementación de celobiosa y la dieta de los donantes para la mayoría de los parámetros de producción de gas. Tanto la tasa fraccional de producción de gas (k) como las tasas máximas de producción de gas aumentaron linealmente (P ≤ 0,025) y la demora inicial en el inicio de la producción de gas (Lag) disminuyó linealmente (P < 0,001) mediante suplementación de celobiosa con el inóculo AFS, sin mostrar diferencias (P > 0,05) entre las dosis de 7,5 y 15. Por el contrario, con el inóculo BFS la suplementación con celobiosa sólo afectó a los valores de k, que aumentaron cuadráticamente (P = 0,043) y tuvieron valores máximos para la dosis de 7,5 de celobiosa. Se observó un efecto cuadrático (P ≤ 0,018) de la suplementación con celobiosa para la producción total de AGV a las 24 h cuando se fermentaron CEL y PEC, obteniéndose la producción máxima de AGV para la dosis de 7,5 de celobiosa. La producción total de AGV para la CEL fue mayor con el inóculo BFS que con el AFS (20,7 vs. 12,9 mmol/L; P = 0,014), pero se observó lo contrario para la Paja (3,97 vs. 6,21 mmol/L; P = 0,005). El uso del inóculo BFS para la fermentación de la CEL redujo el acetato (P = 0,001) y aumentó las proporciones de butirato (P ≤ 0,001) en comparación con el inóculo AFS. Se observó una relación positiva entre las concentraciones totales de AGV en conejos que recibieron los mismos tratamientos experimentales y los valores in vitro cuando se utilizó la Paja como sustrato (r = 0,90; P = 0,015; n = 6). Los resultados sugieren que los factores experimentales influyeron en la actividad fermentativa de la digestión cecal, pero la respuesta observada difirió con el sustrato incubado, siendo la CEL la más afectada. De los resultados encontrados en esta tesis doctoral se puede concluir que las dosis de 7,0 y 7,5 g de celobiosa/L disminuyeron la mortalidad cuando los animales fueron alimentados con piensos con bajo en contenido de fibra soluble. Estos efectos positivos podrían estar relacionados con el aumento en la proporción de butirato observado in vivo e in vitro. Por el contrario, las concentraciones superiores a 7,0 g de celobiosa/L, incrementaron la mortalidad independientemente del contenido de fibra soluble en el pienso. Debido a esto, sería interesante evaluar el potencial sinérgico de la celobiosa con otros oligosacáridos beneficiosos (por ejemplo, xilo-oligosacáridos) para reducir la mortalidad por debajo del umbral del 10%. ----------ABSTRACT---------- The present thesis constitutes a step forward in advancing the knowledge of the supplementation of cellobiose in the drinking water of rabbits and its possible relationship with soluble fibre level in the diet. There is a positive effect of soluble fibre on rabbit digestive health and therefore on the reduction of mortality in weaning rabbits. Nevertheless, this does not seem to end the problem faced by producers. This thesis aims: 1) to determine the adequate dose of cellobiose and its potential interaction with the dietary soluble fibre level, 2) to characterize the ileal and caecal fermentative profile of the cellobiose when combined with different levels of soluble fibre and 3) to evaluate the influence of cellobiose and soluble fibre supplementation on the in vitro caecal fermentation of cellobiose and other carbohydrate-rich feedstuffs. These objectives were developed in six experiments. In experiment one, the aim of the study was to examine whether the combination of dietary soluble fibre and cellobiose exerts a synergistic effect on growth performance, health status, fermentation traits and immune response in rabbits. Six treatments in a 3 × 2 factorial arrangement were used: 3 cellobiose concentrations in drinking water (0.0, 7.5 and 15.0 g/L) × 2 dietary levels of soluble fibre (84.0 and 130 g/kg DM, for the low soluble fibre (LSF) and high soluble fibre (HSF) diets, respectively). A total of 264 young rabbits (35/treatment) were weaned at 34 d of age and had ad libitum access to feed and water. At 46 d of age the other 9 rabbits/treatment were slaughtered and ileal and caecal digesta collected to analyze VFA profile and the immune response in the appendix mucosa. At 48 d of age the cellobiose supplementation was withdrawn and the experimental diets were replaced by a standard commercial diet until 61 d of age. From 34 to 48 d of age there was a linear increase of mortality with the level of cellobiose in the HSF group (0 vs. 17.1%; P = 0.003). In contrast, a quadratic effect of cellobiose level on mortality was found in the LSF group, the rabbits offered 7.5-cellobiose showing the lowest mortality (5.7 vs. 21.4%; P = 0.030). Cellobiose level had a quadratic effect on ADFI, ADG and G:F in this period (P ≤ 0.047), with the 7.5-cellobiose groups having the best growth performance. In contrast, only minor changes on these traits were observed from 48 d of age onwards. Cellobiose level influenced quadratically the ileal VFA concentrations (P = 0.014), showing the maximal value the 7.5-cellobiose groups. In rabbits fed 7.5-cellobiose-LSF a change of acetate to propionate, butyrate and valerate was found in the ileum (P ≤ 0.070). Increasing cellobiose levels reduced linearly caecal VFA concentrations in HSF fed rabbits, but no effect was detected in LSF groups (P = 0.033). The level of soluble fibre increased VFA concentrations in both the ileum (by 22%; P < 0.001) and the caecum (by 11%; P = 0.005). The relative gene expression of IL-6, IL-10, and TNF-α, iNOS, MUC-1 and toll like receptors (TLR-2 and TLR-4) in the appendix increased linear and quadratically with increasing levels of cellobiose (P ≤ 0.063). In conclusion, in rabbits fed LSF diets a dose of 7.5 g cellobiose/L drinking water would be recommended, whereas levels of cellobiose supplementation beyond 7.5 g/L should be avoided in rabbits fed HSF diets. The second, third and fourth experiments were performed to evaluate the effect of supplement cellobiose (≤ 7.0 g/L) on performance of growing rabbits. In experiment 2, six treatments in a 3 × 2 factorial arrangement were used: 3 cellobiose concentrations in drinking water (0.0, 3.5, and 7.0 g/L) × 2 feeds differing in the soluble fibre level (71.9 vs. 130 g/kg DM, for (LSF) and (HSF) diets, respectively). A total of 192 young rabbits (32/treatment) were weaned at 26 d of age and had ad libitum access to feed and water. For experiment 3, the same cellobiose concentrations from experiment 2 were evaluated in rabbits fed with a LSF diet (71.9 g/kg DM) and for this propose, 186 young rabbits (62/treatment) weaned at 26 d of age were used. In experiment 4, four treatments in a 2 × 2 factorial arrangement were structured: 2 cellobiose concentrations in drinking water during the pre-weaning period × 2 cellobiose concentrations in drinking water during the post-weaning period (0.0 and 7.0 g/L in both periods). For the pre-weaning period, 20 litters (10 kits/litter) were used. Each litter was divided at 22 d of age in two groups (5 kits/group) until 29 d of age. From each group 4 kits/litter were weaned at 29 d of age and assigned at random 0.0 or 7.0 g of cellobiose/L. Cellobiose supplementation affected feed intake and feed efficiency in all experiments (P ≤ 0.045). In experiment 2, supplemented 3.50 g of cellobiose/L increased (P = 0.017) weight gain compared with the others cellobiose concentrations (0.0 and 7.0 g of cellobiose/L), resulting in greater weight at 56 d of age (P = 0.017). Results from 26 to 40 d of age in experiment 3 differed from experiment 2, as the increment of cellobiose concentration tended to decrease feed efficiency (P = 0.098). Despite this, from 40 to 50 d of age (experiment 3) this increment the cellobiose concentration increase the feed efficiency (P = 0.009). In experiment 4, from 22 to 29 d of age (pre-weaning period), cellobiose supplementation decreased (P = 0.042) the feed intake. After weaning, from 29 to 43 d rabbits supplemented with cellobiose, increased (P ≤ 0.001) the weight gain and the feed efficiency (51.7 vs. 42.4 g/d and 0.457 vs 0.385 g/g, respectively). The increment of cellobiose concentration tended to reduce the mortality in rabbits fed with LSF diets (experiments 2 and 3; P ≤ 0.098). Contrary, in experiment 4 supplemented the animals with cellobiose in both periods tended to increment the mortality (P = 0.087). In conclusion, supplement moderates concentrations of cellobiose (≤ 7.0 g/L) would be recommended for rabbits fed with LSF diets. In experiment 5, the influence of substrate pre-digestion and donors’ diet on in vitro caecal fermentation of different substrates in rabbits was investigated. Eight hybrid rabbits were fed two experimental diets containing either low (LSF; 84.0 g/kg DM) or high soluble fibre (HSF; 130 g/kg DM) levels. In vitro incubations were conducted using batch cultures with soft faeces as inoculum and four fibrous or fibre-derived, low-starch and low-protein substrates: D-cellobiose (CEL), sugar beet pectin (PEC), sugar beet pulp (SBP) and wheat straw (WS). Substrates in half of the cultures were subjected to a 2-step pepsin/pancreatin in vitro digestion without filtration, and the whole residue (soluble, insoluble and added enzymes) was incubated at 40ºC. Gas production was measured until 144 h, and volatile fatty acid (VFA) production at 24 h incubation was determined. Cultures without substrate (blanks) were included to correct gas production values for gas released from endogenous substrates and added enzymes. Pre-digestion had no influence on in vitro gas production kinetic of WS, and only reduced the time before gas production begins (lag time; by 31%; P = 0.042) for SBP, but for both substrates the pre-digestion decreased the molar proportion of acetate (by 9%; P ≤ 0.003) and increased those of propionate and butyrate (P ≤ 0.014). For CEL, the pre-digestion increased the gas and total VFA production (by 30 and 114%), shortened the lag time (by 32%), and only when it was combined with LSF inoculum 38 percentage units of acetate were replaced by butyrate (P ≤ 0.039). Treatments had a minor influence on in vitro fermentation traits of SBP. The results showed that the pre-digestion process influenced the in vitro caecal fermentation in rabbits, but the effects were influenced by donors’ diet and the incubated substrate. A pre-digestion of substrate is recommended before conducting in vitro caecal fermentations. The level of soluble fibre in the donors’ diet also influenced the in vitro caecal fermentation but its effect depended on the type of substrate. In the last experiment, the in vitro caecal fermentation of five substrates low in starch and protein content [D-(+)-glucose (GLU), D-cellobiose (CEL), sugar beet pectin (PEC), sugar beet pulp (SBP) and wheat straw (WS)] was investigated using as inoculum soft faeces from rabbits receiving different levels of cellobiose and soluble fibre. Twenty four rabbits were supplemented three levels of cellobiose in the drinking water (0.0, 7.5 and 15.0 g/L) and fed two experimental diets containing either low (LSF; 84.0 g/kg DM) or high soluble fibre (HSF; 130 g/kg DM) levels. All substrates were subjected to a two-step pepsin/pancreatin in vitro pre-digestion, and the whole residue was used as substrate for the in vitro incubations. Gas production was measured until 144 h, and volatile fatty acid (VFA) production was determined at 24 h incubation. Experimental treatments did not affect SBP fermentation and had only a subtle influence on fermentation of WS and GLU. In contrast, fermentation of CEL was markedly affected, and cellobiose supplementation × donors’ diet interactions were detected for most gas production parameters. Both, the fractional gas production (k) and maximal gas production rates were linearly increased (P ≤ 0.025) and the initial delay in the onset of gas production (Lag) linearly decreased (P < 0.001) by cellobiose supplementation with the HSF inoculum, with no differences (P > 0.05) between the 7.5 and 15 doses. In contrast, with the LSF inoculum cellobiose supplementation only affected k values, which were quadratically increased (P = 0.043) and had maximal values for the 7.5 dose. A quadratic effect (P ≤ 0.018) of cellobiose supplementation was observed for total VFA production at 24 h when CEL and PEC were fermented, obtaining the maximal VFA production for the 7.5 dose of cellobiose. Total VFA production for CEL was greater with LSF than with HSF inoculum (20.7 vs. 12.9 mmol/L; P = 0.014), but the opposite was found for WS (3.97 vs. 6.21 mmol/L; P = 0.005). The use of LSF-inoculum for CEL fermentation sharply reduced acetate (P = 0.001) and increased butyrate proportions (P ≤ 0.001) compared with the HSF-inoculum. A positive relationship between total VFA caecal concentrations in rabbits receiving the same experimental treatments and in vitro values was only observed when WS was used as substrate (r = 0.90; P = 0.015; n = 6). The results suggest that experimental factors influenced the fermentative activity of caecal digesta, but the observed response differed with the incubated substrate, being the CEL the most affected. From the results found in this PhD Thesis it can be concluded that a doses of 7.0-7.5 g of cellobiose/L decreased the mortality when the animals where fed with diets low in soluble fibre content. This positive effect might be related with the increased in the butyrate proportion observed in vivo and in vitro. In contrast, a concentration higher than 7.0 g of cellobiose/L, increased the mortality independently of the soluble fibre content. Accordingly, it would be interesting to evaluate the synergic potential of the cellobiose with other beneficial oligosaccharides (e.g., xylo-oligosaccharides) in order to reduce mortality below the threshold of 10%.

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Item ID: 50232
DC Identifier: http://oa.upm.es/50232/
OAI Identifier: oai:oa.upm.es:50232
DOI: 10.20868/UPM.thesis.50232
Deposited by: Archivo Digital UPM 2
Deposited on: 30 May 2018 06:44
Last Modified: 30 Oct 2018 23:30
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