Study of the interaction strength between Pru p 3 and its ligand by Atomic Force Microscopy = Estudio de la fuerza de interacción entre Pru p 3 y su ligando mediante Microscopía de Fuerza Atómica

Resumen

Allergic reactions are one of the most prevalent diseases of the 21st century and understanding the molecular mechanisms by which this pathology occurs can help us in the future development of immunotherapies. Recent research shows the role of ligands carried by allergenic proteins has become increasingly relevant, they can act as an adjuvants in the immune reaction, playing an important role in the allergic processes. Therefore, in this study, an approach to the protein-ligand interaction in allergies, using Affinity Atomic Force Microscopy will be carried out. For this purpose, the main peach allergen (Pru p 3) will be produced recombinantly using the yeast Pichia pastoris as expression system. On the other hand, its native ligand, a hydroxylated derivative of camptothecin bound to phytosphingosine, will be chemically synthesized. Both compounds will be purified using different chromatographic methods.

Once obtained, the second part of this study could be initiated. This second step consisted in the use of A-AFM (Affinity Atomic Force Microscopy), as a tool used to measure the interaction strength between Pru p 3 and its ligand. To perform this test, the ligand should be fixed on a silicon substrate/glass slide holder, and the Pru p 3 should be fixed on a silicon nitride AFM chip, both functionalized with (3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES) by the Activated Vapor Silanization (AVS) method. With the results obtained, force-distance curves could be analysed to determine the interaction strength of Pru p 3 and its ligand. Although it could not be measured due to lack of resolution, great progress was made in the attachment of the compounds to the study surface.

ABSTRACT

Las reacciones alérgicas son una de las enfermedades más prevalentes del siglo XXI y la comprensión de los mecanismos moleculares por los que se produce esta patología puede ayudarnos en el futuro desarrollo de inmunoterapias. Recientes investigaciones demuestran que el papel de los ligandos que portan las proteínas alergénicas es cada vez más relevante, ya que pueden actuar como adyuvantes en la reacción inmune, jugando un papel importante en los procesos alérgicos. Por ello, en este estudio se realizará una aproximación a la interacción proteína-ligando en las alergias, utilizando la Microscopía de Fuerza Atómica de Afinidad. Para ello, se producirá el principal alérgeno del melocotón (Pru p 3) de forma recombinante utilizando la levadura Pichia pastoris como sistema de expresión. Por otro lado, se sintetizará químicamente su ligando nativo, un derivado hidroxilado de la camptotecina unido a fitoesfingosina. Ambos compuestos se purificarán utilizando diferentes métodos cromatográficos.

Una vez obtenidos, se podrá iniciar la segunda parte de este estudio. Este segundo paso consistió en el uso de A-AFM (Microscopía de Fuerza Atómica de Afinidad), como herramienta utilizada para medir la fuerza de interacción entre Pru p 3 y su ligando. Para realizar este ensayo, el ligando debía fijarse en un sustrato de silicio/soporte de vidrio, y la Pru p 3 debía fijarse en un chip de AFM de nitruro de silicio, ambos funcionalizados con (3-Aminopropil) trietoxisilano (APTES) por el método de Silanización por Vapor Activado (AVS). Con los resultados obtenidos, se pudieron analizar las curvas fuerza-distancia para determinar la fuerza de interacción de Pru p 3 y su ligando. Aunque no se pudo medir por falta de resolución, se lograron grandes avances en la fijación de los compuestos a la superficie de estudio.