Aislamiento y caracterización de anticuerpos con potencial terapéutico frente a la alergia al polen de abedul y a la manzana = Isolation and molecular characterization of antibodies with therapeutic potential for birch polinosis and related apple allergy

Resumen

El polen de abedul es una de las principales causas de enfermedades mediadas por la inmunoglobulina E en países del norte y centro de Europa y en Norteamérica. Los pacientes con alergia al polen de abedul suelen desarrollar alergia alimentaria, especialmente a la manzana. Este tipo de alergia alimentaria se produce como consecuencia de la reactividad cruzada entre el principal alérgeno del polen de abedul (Bet v 1) y su homólogo presente en la manzana (Mal d 1).

Anticuerpos recombinantes con actividad bloqueadora frente a ambos antígenos son candidatos para la generación de vacunas pasivas. Por esta razón, a partir del repertorio de anticuerpos de individuos alérgicos al polen de abedul y a la manzana, que desarrollaron tolerancia a manzana tras el tratamiento con inmunoterapia sublingual (SLIT), se propone aislar anticuerpos con potencial terapéutico para ambas alergias.

A partir de células mononucleares de sangre periférica de un paciente en el que se indujo la tolerancia al alérgeno de manzana tras el tratamiento sublingual con Mal d 1, se construyó una genoteca combinatoria de fragmentos de anticuerpos (Fab) expresados en la superficie de levadura. Se aislaron clones que mostraban fragmentos Fab reactivos frente Bet v 1 y/o Mal d 1 y posteriormente, estos Fab se reformaron como anticuerpos IgG1, que se produjeron como proteínas recombinantes usando células de mamífero como sistema de expresión. Finalmente, se analizó su afinidad de unión y sus propiedades biofísicas (Ej. Estado monomérico), mediante ELISA y HPLC, respectivamente.

A pesar del elevado número de clones de levaduras que expresaban Fab reactivos frente ambos antígenos o al menos uno de ellos, solo se identificó un anticuerpo IgG1 con fuerte reactividad frente al antígeno Bet v 1 en formato soluble. Para evaluar su capacidad de bloquear las reacciones alérgicas in vitro se propone una prueba de activación de basófilos con este anticuerpo.

Pese a que no se aislaron anticuerpos con reactividad cruzada, los conocimientos adquiridos en este proyecto desarrollaron las herramientas esenciales para la búsqueda de potentes anticuerpos reactivos en pacientes inmunizados con posible aplicación terapéutica.

Abstract

Birch pollen is one of the most common causes of Immunoglobulin E-mediated diseases in Northern and Central Europe and North America. In addition, it is known that patients with birch pollen allergy often develop allergic reactions to food allergens, most commonly to apple. This birch pollinosis-related apple allergy is considered to occur as a consequence of immunological cross reactivity between the major birch pollen allergen (Bet v 1) and the structurally related major apple allergen (Mal d 1).

Recombinant antibodies with cross-blocking activity represent candidate vaccines for passive immunotherapy. Thus, sourcing the repertoire of antibodies from Mal d 1 sublingual immunotherapy (SLIT)-treated birch pollen-allergic individuals with apple allergy, where tolerance to apple was induced, we intended to isolate antibodies with potential for concomitant treatment of both birch pollinosis and related food allergies.

From a combinatorial antibody fragment library using yeast surface display already constructed from PBMCs of a patient who tolerated apple antigen after sublingual treatment with Mal d 1, we isolated clones displaying Fab fragments reactive with Bet v 1 and/or Mal d 1. Subsequently, these isolated Fab fragments were reformatted into full-length IgG1 antibodies and produced as recombinant proteins in a mammalian expression system. Finally, their binding affinity and their biophysical properties, such as monomeric status, were analysed using ELISA and HPLC, respectively.

Despite the high number of Fab clones that appeared to be good binders to both antigens or only one of them, only one full length IgG antibody was identified with strong reactivity against Bet v 1 in soluble format. For prospective studies we proposed a basophil activation test with this potential antibody to assess its ability to block allergic reactions in vitro.

Although no cross-reactive antibodies were isolated, the insights gained in this project developed the essential tools for the search of potent reactive antibodies in immunized patients with therapeutic potential.